從培養(yǎng)7 d的PDA平板上刮取適量菌絲,CATB法提取DNA,以引物ITS1/ITS4進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物在上海生工生物有限公司進行測序,測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對。

1.2.2  田間藥效篩選試驗

選用小盾殼霉、哈茨木霉、腐霉利、甲基硫菌靈、嘧菌酯、吡唑醚菌酯和啶酰菌胺7種藥劑,每種藥劑設2個梯度稀釋濃度,另設1個清水空白對照,共15個處理。每個處理小區(qū)15株桑樹,隨機排列,每個處理設3次重復。桑樹初花期(5%開花)第1次用藥,間隔7 d后第2次施藥。桑葚果實轉色成熟時調查1次,每個處理定點調查4株樹,記錄每個處理健康桑果粒數(shù)、病果粒數(shù)。計算總果粒數(shù)、病果率和校正防效。

1.2.3  植物安全性試驗

根據(jù)農(nóng)藥對農(nóng)作物安全性評價準則(NY/T 1965.1-2010),選取十大、白玉王和白珍珠3個常見品種為試驗對象,將50%啶酰菌胺水分散粒劑用水溶液配制成416.65、833.3、1250、1,666.6 g a.i./hm2的濃度(即田間最高劑量的1、2、3、4倍),以清水作對照處理。將不同品種的果桑苗(每品種2盆)置于噴霧塔內,噴施不同濃度的50%啶酰菌胺水分散粒劑藥液(精確噴霧面積為0.2 m2,噴藥液10 mL,噴藥量為500 L/hm2,噴霧壓力為0.5 kPa)。噴藥后的果桑苗在自然條件下放置2 h,待葉片上藥液風干后移至27℃、相對濕度為50%、12D/12L、光強3,000 lx的人工氣候培養(yǎng)室中,試驗設4個重復,每2盆果桑作為1次重復。試驗噴藥前測量供試果桑苗萌發(fā)新梢的長度并標記；噴藥處理后14 d再測量標記新梢的梢長。用施藥后平均新梢長度減去施藥前平均新梢長度計算新梢的伸長值。試驗期間,每隔2d觀察果桑苗生長狀態(tài)和葉色變化,施藥后第14天拍照。

1.2.4  啶酰菌胺農(nóng)藥登記試驗

在江蘇省宜興市、江西省南昌縣和四川省青神縣3地進行試驗,每個地區(qū)4個重復,50%啶酰菌胺水分散粒劑設置600、800、1,000倍液3個濃度梯度,以20%嘧菌酯可濕性粉劑400倍液為對照,觀察防治效果。桑樹初花期(5%開花)第1次用藥防治,間隔7 d后第2次施藥。桑葚果實轉色成熟時調查1次,每個處理定點調查4株樹,記錄每個處理健康桑果粒數(shù)、病果粒數(shù)。計算總果粒數(shù)、病果率和校正防效。

1.2.5  啶酰菌胺在桑葚中殘留試驗

在江蘇省鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)、湖南省長沙縣、河南省濟源市和四川省廣漢市4地試驗小區(qū)各設置1個處理小區(qū),1個對照小區(qū),每個小區(qū)4株桑葚,以制劑量600倍液(有效成分833.3 mg/kg)施藥2次,間隔7 d。最后1次施藥后的第7天和第14天分別采集成熟的桑葚果實樣品,準確稱取5 g桑葚于50 mL離心管中,加入25 mL乙腈,研磨振蕩30 min,然后以5,000 r/min離心5 min,取0.5 mL上清液加1.5 mL乙腈混溶后,過0.22μm濾膜于1 mL進樣瓶中,用液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)法測定殘留量(GB 20769-2008)。在毒理學和化學殘留量基礎上,根據(jù)我國居民膳食消費量,估算農(nóng)藥膳食攝入量,包括長期/短期膳食攝入,評估膳食風險。

1.3  數(shù)據(jù)分析

1.3.1  田間藥效篩選試驗、啶酰菌胺農(nóng)藥登記試驗

式中：PT為處理區(qū)病果率,CK為對照區(qū)病果率。

相關試驗數(shù)據(jù)采用鄧肯氏新復極差“DMRT”法,利用DPS軟件進行統(tǒng)計分析。

1.3.2  啶酰菌胺在桑葚中殘留量計算

式中：R為樣品中測試物殘留量(mg/kg),C為樣品提取溶液濃度-進樣小瓶在儀器中檢測出的質量濃度(mg/L),V1為樣品溶液的最終定容體積(2 mL,0.5 mL上清液+1.5 mL乙腈),V2為樣品溶液的移取體積(0.5 mL),V3為樣品提取溶液總體積(25 mL),W為樣品質量5 g。

1.3.3  啶酰菌胺在桑葚中的膳食風險評估

計算國家估算每日攝入量：

式中：STMRi為農(nóng)藥在某種食品中的規(guī)范殘留試驗中值(mg/kg)；STMR-Pi為采用加工因子校正后的規(guī)范殘留試驗中值(mg/kg)；Fi為一般人群對該食品的消費量(kg)；b.w.為我國普通人群人均體質量,按63 kg計；RQ為風險商(%)；ADI為農(nóng)藥的每日允許攝入量(mg/kg b.w.)。在計算NEDI時,如果沒有合適的STMR值或STMR-Pi值,可直接采用相應的MRL值代替。當RQ≤100%時,認為該農(nóng)藥殘留對一般人群健康的影響在可接受的風險水平,值越小,風險越低。

02
結果與分析
2.1  桑葚菌核病的病原菌鑒定

在江蘇省宜興市、江西省南昌縣和四川省青神縣試驗區(qū)采集的桑葚菌核病病果上,累計分離獲得16株病原菌。ITS序列同源性比對分析結果顯示16株病原菌均為核地仗菌(Scleromitrula shiraiana)。形態(tài)學鑒定結果表明：在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后,氣生菌絲發(fā)達,菌落表面呈灰色茸毛狀,再繼續(xù)培養(yǎng)7 d后,發(fā)現(xiàn)菌落表面呈淺綠色氈狀,緊貼培養(yǎng)基生長,菌落邊緣不整齊,接近菌落邊緣可看到小粒菌核凸起。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),分生孢子為卵圓形,一側略尖,符合核地仗菌的形態(tài)特征。形態(tài)學和分子鑒定結果表明,試驗地桑葚菌核病病原均為核地仗菌。

2.2  桑葚菌核病田間藥效篩選試驗

根據(jù)病原鑒定結果,選取對核地仗菌離體活性效果較好的吡唑醚菌酯、嘧菌酯、啶酰菌胺以及桑農(nóng)常用的甲基硫菌靈和腐霉利,同時增加對子囊菌作用效果較好的盾殼霉和哈茨木霉2種生物農(nóng)藥于2018年在江蘇省宜興市開展田間藥效篩選試驗。

篩選試驗結果表明：7種藥劑對桑葚菌核病均有一定防效,各藥劑防治后,桑葚菌核病的病果率雖然都出現(xiàn)了下降,但不同藥劑的防效存在明顯差異。其中吡唑醚菌酯對桑葚菌核病防效優(yōu)良,防效達到90%；嘧菌酯和啶酰菌胺防效良好,防效在85%以上；3種藥劑都能將病果率控制在10%以下。桑農(nóng)常用的甲基硫菌靈和腐霉利對桑葚菌核病防效中等偏差,其中腐霉利低劑量防效僅為36%；哈茨木霉菌和盾殼霉對桑葚菌核病防效較差,高劑量防效均低于40%,病果率達到30%(見表1)。

2.3  啶酰菌胺對桑葚菌核病的防效

根據(jù)江蘇省宜興市田間篩選試驗結果,新煙酰胺類殺菌劑啶酰菌胺對桑葚菌核病防效較好,綜合考慮防效、登記現(xiàn)狀及抗藥性等因素,選取啶酰菌胺為代表性藥劑,進一步開展田間防效、安全性及殘留檢測等系列試驗。將吡唑醚菌酯和嘧菌酯作為儲備藥劑,用于后續(xù)開發(fā)和登記。

為進一步明確啶酰菌胺在不同地區(qū)對桑葚菌核病作用效果及防效穩(wěn)定性,細化使用劑量,根據(jù)農(nóng)藥田間試驗準則,于2020年在江蘇省宜興市、江西省南昌縣和四川省青神縣3地桑葚主產(chǎn)區(qū)開展了啶酰菌胺防治桑葚菌核病田間試驗。試驗結果顯示：在江蘇地區(qū),50%啶酰菌胺水分散粒劑600、800、1,000倍液于初花期施藥對桑葚菌核病的防效為88%～95%,在江西地區(qū)防效為76%～82%,在四川地區(qū)防效為71%～87%,3地防效雖有一定差異,但均高于70%,生產(chǎn)中可有效防控桑葚菌核病(見表2)。另外試驗過程中,3地果桑正常生長,未觀察到藥害癥狀。

2.4  啶酰菌胺對桑葚的安全性評價

2020年在江蘇省句容市開展啶酰菌胺對果桑的安全性試驗,結果表明：不同濃度藥液噴霧的果桑苗葉色、葉形和株型與空白對照處理果桑苗沒有變化,桑葚生長正常。試驗同時發(fā)現(xiàn)：啶酰菌胺不同濃度藥液噴霧后對果桑新梢的伸長均有促進作用,藥劑處理組桑苗新梢伸長的長度大于對照處理組,統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)十大和白珍珠2個品種的新梢伸長值顯著高于對照處理(見表3)。

2.5  啶酰菌胺在果桑中的殘留量

根據(jù)殘留試驗指南要求,在江蘇省鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)、河南省濟源市、四川省廣漢市和湖南省長沙縣4地開展了殘留試驗。參考國標：水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關化學品殘留量的測定(GB 20769-2008)和已報道文獻,采用液相色譜-串聯(lián)質譜法測定殘留量。結果表明：啶酰菌胺在末次施藥7、14 d后在果桑中的最高殘留量分別為7.4、3.5 mg/kg,低于國家標準(GB 2763-2019規(guī)定漿果和其他小型水果中啶酰菌胺殘留最大值為10 mg/kg),即距離末次施藥7、14 d后采摘果桑安全(見表4)。

2.6  啶酰菌胺在果桑中膳食風險

根據(jù)我國農(nóng)藥登記和居民的人均膳食結構情況分析,普通人群啶酰菌胺的國家估算每日攝入量是1.30mg,占日允許攝入量的50.38%,膳食風險可接受(見表5)。

03
討論與結論

選擇合適藥劑是保證防治效果的決定因素。田間篩選試驗表明,甲氧基丙烯酸酯類的吡唑醚菌酯、嘧菌酯和煙酰胺類的啶酰菌胺對桑葚菌核病效果較好,符合生產(chǎn)需求。3種藥劑均為廣譜類高效低毒藥劑,且都作用于病原菌線粒體,干擾病原菌能量供應。因啶酰菌胺登記作物種類較多,因此選擇啶酰菌胺為代表藥劑開展了后續(xù)安全性試驗、3地田間防效試驗和殘留試驗,且試驗效果較好。吡唑醚菌酯和嘧菌酯目前還未在喬木類木本植物上登記,殘留和植物安全性試驗有待進一步明確,可作為桑葚菌核病防治的技術儲備藥劑。

生產(chǎn)中常用的苯并咪唑類殺菌劑甲基硫菌靈和二甲酰亞胺類殺菌劑腐霉利對桑葚菌核病防效中等偏差,這與農(nóng)藥作用機制及生產(chǎn)中長期高劑量使用相關。以腐霉利為例,其作用機制是抑制病原菌體內甘油三酯的合成,主要作用于葡萄孢屬和核盤菌屬真菌,非桑葚菌核病病原核地仗菌的最佳防治藥劑。生產(chǎn)中,甲基硫菌靈和腐霉利是最常用、最濫用的殺菌劑,由此引發(fā)的病菌抗藥性和殘留風險居高不下。建議田間防治以啶酰菌胺等藥劑替代甲基硫菌靈和腐霉利,以保證桑葚菌核病的田間防治效果。

安全性是農(nóng)藥推廣技術的重要指標之一,多數(shù)特色作物如菊花、月季對農(nóng)藥較為敏感,常規(guī)劑量下易產(chǎn)生藥害,這主要決定于植物自身遺傳特性和農(nóng)藥作用方式。桑葚屬喬木類木本植物,未有相關安全性試驗報道。本次安全性試驗結果表明,啶酰菌胺對果桑植株具有較高的安全性。此外,啶酰菌胺對果桑新梢伸長具有促進作用,但前期未見相關研究報道,具體促生機制有待進一步研究。

農(nóng)藥殘留引發(fā)的農(nóng)產(chǎn)品質量安全是百姓關注的熱點話題之一。前期研究發(fā)現(xiàn)啶酰菌胺在多種草本植物和葡萄等藤本類木本植物上殘留符合國家標準,安全間隔期一般為7 d,但在生菜等極少數(shù)特經(jīng)作物上殘留嚴重超標。目前,未見啶酰菌胺在桑葚等喬木類木本植物上殘留試驗報道。本試驗首次在喬木類木本植物上開展啶酰菌胺的殘留試驗,江蘇、河南、湖南、四川4地樣品中啶酰菌胺的殘留值及膳食風險均處于可接受范圍內,安全間隔期為7 d,為啶酰菌胺登記用于桑葚菌核病的防治提供了安全性支持。另外,試驗中4地的殘留值有一定差異,江蘇為7.2 mg/kg,明顯高于其余3地,但仍在國家限量(10 mg/kg)范圍內,這可能與桑葚品種、種植環(huán)境等多種因素相關。試驗結果與啶酰菌胺在南瓜、蘆筍和木瓜上的殘留結論一致。因此,在生產(chǎn)實踐中需嚴格按照推薦用量施藥,盲目提高施藥量易引發(fā)殘留超標。

試驗通過系列試驗確認了在桑葚初花期(開花量5%)噴施50%啶酰菌胺水分散粒劑600～1,000倍液,間隔7～14 d后第2次施藥,對桑葚菌核病防效較好,對桑葚植株安全,藥劑施用的為安全間隔期7 d,而且啶酰菌胺在果桑中的殘留量符合國家標準,膳食風險可接受。因此,啶酰菌胺可作為生產(chǎn)中防治桑葚菌核病的首選藥劑,極具推廣價值。輪換用藥方面可以考慮吡唑醚菌酯和嘧菌酯,試驗結果有待于今后進一步驗證。